在开发生物制品，具体而言是治疗性蛋白产品时，不必要的免疫反应不仅对患者有害，而且还会抑制产品的功效。保持正确的高级结构 (HOS) 对于确保生物制药产品的适当功能、活性和稳定性至关重要。完善的 HOS 检定方法方案是完整产品检定方案的重要组成部分。我们所有的生物物理检定分析均经过认证和验证，可用于您产品的常规批放行或稳定性研究。
分析型超速离心 (AUC) 可直接在溶液中分离蛋白质种类，无需使用固定相，例如尺寸排阻色谱 (SEC)。分子的沉降速率由离心力引起，并通过紫外吸光度、荧光或干涉测量法连续监测，以产生检测样本中存在的物质的尺寸分布图。沉降速度分析型超速离心 (SV-AUC) 生成沉降系数值并报告单体、多聚物和聚合物种类的相对百分比。还可获得有关分子量 (MW) 和流体力学形状的信息。
差示扫描量热法 (DSC) 通过以恒定速率加热分子进行，并记录与热变性相关的热容量的可检测变化。单个 DSC 实验可以确定转变中点 Tm 以及与展开相关的焓 (ΔH) 和热容变化 (ΔCp)。DSC 是一种非常有用的生物物理检定技术，用于比较同一产品的批次，以确保批次间的一致性、制造变化时产品的可比性，并建立生物相似性。
圆二色性 (CD) 测量由结构不对称引起的圆偏振光吸收的差异。远紫外扫描 (195-250 nm) 取决于肽键排列/定位。对远紫外线中的椭圆度数据进行去卷积以估计二级结构，例如 α-螺旋、β-折叠或无规卷曲。近紫外扫描 (250-350 nm) 测量芳香族残基和二硫键发色团的吸光度。该光谱范围内的 CD 信号提供蛋白质整体三级结构的指纹。
动态光散射 (DLS) 提供有关分散或溶解在液体中的颗粒乳剂和分子的水动力学尺寸和尺寸分布的信息。总体尺寸信息用分布曲线表示。动态光散射可以测量蛋白质的扩散系数、水动力学尺寸和预估分子量。
内源色氨酸荧光 (ITF) 评估蛋白质的构象状态。折叠蛋白的内源荧光主要是由于色氨酸残基发射，还有一小部分来自酪氨酸和苯丙氨酸残基。色氨酸的最大吸收波长为 280 nm，其发射峰为溶致变色，根据当地环境的极性从 300 到 350 nm 不等。因此，ITF 被用作蛋白质结构检定的诊断方法。
荧光偏振各向异性 (FPA) 通过相对较小的荧光发射配体与较大的受体分子的相互作用来确定结合常数。这种生物物理检定技术基于使用偏振光来激发荧光分子，荧光分子又会发出偏振光。然而，发射光的偏振度和各向异性直接取决于荧光分子的旋转扩散。因此，各向异性的测量可用于在改变配体相对于其受体的浓度时生成结合曲线。然后可以从各自的结合曲线计算亲和力常数。
表面等离子体共振 (SPR) 蛋白质结合研究通常使用 biacore 仪器并采用各种配置和形式，包括蛋白质:蛋白质和蛋白质:药物结合研究。可以开发用于先导选择的排序筛选方法以及优化运行条件以确定 IND/CMC 程序的 Kon、Koff 和 KD 值，作为产品生物物理检定的一部分。
非极性荧光染料 8-Anilinonaphthalene-1-磺酸 (ANS) 方法评估蛋白质在其天然状态下的表面疏水性。此方法是一种相对快速、无损且简单的定量评估蛋白质非极性或疏水性的方法。蛋白质表面疏水位点的数量和相对大小可能受 pH、温度和离子强度条件的影响。随着分子展开，更多的疏水区域暴露出来。因此，该方法对蛋白质的构象状态非常敏感。
具有多角度激光散射 (SEC-MALLS) 检测的尺寸排阻色谱法用于根据尺寸分离蛋白质并确定分离蛋白质的摩尔质量。大分子量 (>200 kDa) 的角度依赖性也可用于估计大小和形状因素，例如蛋白质回转半径。
傅里叶变换红外 (FT-IR) 光谱是一种成熟的实验技术，用于分析多肽和蛋白质的二级结构。通过 FT-IR 分析多肽和蛋白质会产生一系列特征性的 IR 吸收带。酰胺 I 和 II 带是蛋白质骨架的两个最重要的振动带。此外，两个酰胺带中更敏感的是酰胺 I 带（1700-1600 cm-1），它对应于肽键的 C=O 拉伸振动。酰胺 I 带成分的频率与蛋白质的二级结构特征密切相关。
观看此网络研讨会，探讨 AUC 分析的新参数以及如何保持符合 ICH 指导方针。了解如何为您的 AAV 项目弥合从传统方法到高质量 AUC 平台的差距。
一种需要完成的生物物理检定是聚合与分类。蛋白质聚合物定义为任何自相关的蛋白质种类，可根据以下五个特征进行分类：大小、可逆性/解离、构象、化学修饰和形态。以下是我们的一些蛋白质聚合物分析方法：
对于 AAV 样本的常规 AUC 分析，我们通常的要求是约 0.200 mL，浓度约为 1e13 vg/mL。在 1e13 vg/mL 的情况下，一次验证最多可消耗 5 mL 或更多。虽然 AUC 样本要求不小，但我们目前正在研究减少它们的方法。
我们有许多确保对齐的机制，包括常见的方法：使用细胞和转子上的标记进行目视对齐以及使用对齐工具。我们正在试验一种利用图像分析的定量对齐方法。
AUC 在 rAAV 产品的批放行中变得越来越有用。很难准确说出现在有多少申请包括 AUC，但我们相信这会增加，并将包含在未来的 FDA 指导文件中。
异质样本可能会带来许多问题。特别是，如果主要物种，即“完整”衣壳的丰度较低，或与部分包装变体等杂质的丰度水平相当。如果样本非常异质，建议在对非理想产品批次进行非常深入的研究之前，先了解纯化策略。
15,000 - 20,000 rpm 范围内的离心速度是最常见的并且可能获得最佳的 AAV 样本的empty/full分辨率，尽管有时可能会使用低至 12,000 rpm 的速度。如果速度太慢，则扩散导致的轮廓加宽会导致分辨率变差，而更快的速度可能会使较大的物质过快沉积，从而导致它们在拟合中代表性不足。
